COMPACTAÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO E MECANISMOS EPIGENÉTICOS ASSOCIADOS

6 – COMPACTAÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO E MECANISMOS EPIGENÉTICOS ASSOCIADOS

O DNA cromossômico existe na forma de moléculas muito longas que estão condensadas para se encaixar nos pequenos limites de uma célula. A estrutura do DNA pode ser considerada em três níveis hierárquicos: a estrutura primária do DNA - é sua cadeia de nucleotídeos; a estrutura secundária - é a hélice de fita dobrada; e a estrutura terciária - refere-se à dobra de ordem superior que possibilita que o DNA seja acondicionado no espaço restrito de uma célula.

Um tipo de estrutura terciária do DNA é o superenrolamento, que ocorre quando a hélice do DNA está sujeita à tensão ao ser supercontorcida ou subcontorcida. O menor estado de energia para o B-DNA é quando ele tem aproximadamente 10 pb por volta de sua hélice. Nesse estado relaxado do DNA, uma distância de 100 pb de DNA teria cerca de 10 voltas completas. Se a energia é usada para adicionar ou remover qualquer volta, coloca-se tensão na molécula, fazendo com que a hélice superenrole ou gire sobre si mesma. Moléculas com rotação adicional exibem superenrolamento positivo. Moléculas com falta de rotação exibem superenrolamento negativo. O superenrolamento é uma solução parcial para o problema de condensação do DNA da célula porque o DNA superenrolado ocupa menos espaço que o DNA relaxado.

O superenrolamento depende das topoisomerases, enzimas que adicionam ou removem rotações da hélice do DNA ao romper temporariamente as fitas de nucleotídeos, girando as extremidades ao redor de si mesmas e então restituindo as extremidades rompidas. Assim, as topoisomerases podem induzir ou aliviar o superenrolamento, embora nem todas as enzimas topoisomerases exerçam ambas as funções.

Os cromossomos eucarióticos contêm muito DNA. Como o cromossomo bacteriano, cada cromossomo eucariótico tem uma única molécula de DNA extremamente longa. Para que esse DNA se encaixe no núcleo, é necessário um enorme esforço de condensação e dobra, cuja intensidade varia durante o ciclo celular. Os cromossomos estão em um estado alongado, relativamente não condensado durante a interfase do ciclo celular. Embora o DNA dos cromossomos na interfase esteja menos condensado do que o DNA dos cromossomos mitóticos, ele ainda está muito condensado; está apenas menos condensado. No curso do ciclo celular, o nível de condensação do DNA muda: os cromossomos progridem de um estado altamente condensado para um estado de extrema condensação, necessário para o movimento dos cromossomos na mitose e meiose. A condensação do DNA também muda localmente na replicação e transcrição, quando as duas fitas de nucleotídeos devem abrir e as sequências de bases em questão estão expostas. Assim, a condensação do DNA eucariótico (sua estrutura cromossômica terciária) não é estática – ela muda regularmente em resposta aos processos celulares.

O DNA eucariótico na célula está intimamente associado às proteínas. Essa combinação de DNA e proteínas é chamada de cromatina. Os dois tipos básicos de cromatina são a eucromatina, que sofre o processo normal de condensação e descondensação no ciclo celular, e a heterocromatina, que permanece em um estado altamente condensado durante todo o ciclo celular, mesmo durante a interfase. A eucromatina constitui a maior parte do material cromossômico e é onde grande parte da transcrição ocorre. Todos os cromossomos têm heterocromatina permanente (chamada de heterocromatina constitutiva) nos centrômeros e telômeros; o cromossomo Y também é composto, em grande parte, por heterocromatina constitutiva. A heterocromatina ainda pode ocorrer durante alguns estágios de desenvolvimento, e é então chamada de heterocromatina facultativa. Por exemplo, a heterocromatina facultativa ocorre ao longo de um cromossomo X inteiro nas fêmeas dos mamíferos quando esse X se torna inativo. Além de permanecer condensada durante todo o ciclo celular, a heterocromatina é caracterizada pela falta generalizada de transcrição, ausência de crossing over e replicação tardia na fase S. As diferenças entre a eucromatina e a heterocromatina estão resumidas no Quadro 11.1. (PIERCE-SE QUISER DAR UMA OLHADA).

            As proteínas mais abundantes na cromatina são as histonas, pequenas proteínas com carga elétrica positiva, com cinco tipos principais: H1, H2A, H2B, H3 e H4. Todas as histonas apresentam elevada porcentagem de arginina e lisina, aminoácidos com carga positiva que conferem às histonas uma carga elétrica efetiva positiva. As cargas positivas atraem as cargas elétricas negativas dos fosfatos do DNA; essa atração mantém o DNA em contato com as histonas. Uma porção heterogênea das proteínas cromossômicas não histona também é encontrada nos cromossomos eucarióticos. De vez em quando, histonas variantes, com algumas sequências diferentes de aminoácidos, são incorporadas na cromatina no lugar de uma das principais histonas.

A cromatina tem uma estrutura muito complexa com vários níveis de organização. O nível mais simples é a estrutura de dupla-hélice do DNA. Em um nível mais complexo, a molécula de DNA está associada a proteínas e está muito dobrada para produzir um cromossomo. Quando a cromatina é isolada do núcleo de uma célula e visualizada com um microscópio eletrônico, ela aparece como um colar de pérolas. Se uma pequena quantidade de nuclease é adicionada a essa estrutura, a enzima rompe o “colar” entre as “pérolas”, deixando as pérolas individuais presas a cerca de 200 pb de DNA. Se mais nuclease é adicionada, a enzima digere todo o DNA entre as pérolas e deixa um cerne de proteínas preso a um fragmento de DNA. Tais experimentos demonstraram que a cromatina não é uma associação aleatória de proteínas e DNA, mas tem uma estrutura fundamental repetida. O cerne repetido de proteína e DNA produzido pela digestão com as enzimas de nuclease é o nível mais simples da estrutura da cromatina, o nucleossomo. O nucleossomo é uma partícula do cerne composta por DNA dobrado cerca de duas vezes ao redor de um octâmero de oito proteínas histonas (duas cópias de H2A, H2B, H3 e H4), muito semelhante a um fio enrolado ao redor de um carretel. O DNA em contato direto com o octâmero de histonas tem entre 145 e 147 pb de comprimento. Cada uma das proteínas histona que compõe a partícula cerne do nucleossomo tem uma “cauda” flexível, contendo de 11 a 37 aminoácidos, que se estende para fora do nucleossomo. Os aminoácidos com carga positiva encontrados nas caudas das histonas interagem com as cargas negativas dos fosfatos no DNA, mantendo o DNA e as histonas intimamente associadas. As caudas de um nucleossomo também podem interagir com os nucleossomos vizinhos, o que facilita a compactação destes. As modificações químicas nas caudas de histona provocam mudanças na estrutura da cromatina, necessárias à expressão do gene.

O quinto tipo de histona, H1, não é uma parte da partícula do cerne do nucleossomo, mas tem um papel importante na estrutura do nucleossomo. A H1 liga de 20 a 22 pb de DNA onde o DNA se une e deixa o octâmero, ajudando a manter o DNA no lugar, como um grampo ao redor do octâmero do nucleossomo. Cada nucleossomo abriga cerca de 167 pb de DNA. Os nucleossomos estão localizados em intervalos regulares ao longo da molécula de DNA e estão separados um do outro pelo DNA ligador (linker DNA), que tem tamanho variado entre os tipos de células; na maioria delas, o DNA ligador inclui entre 30 e 40 pb. As proteínas cromossômicas não histona pode estar associadas a esses DNA ligador, e algumas também parecem se ligar diretamente à partícula do cerne.

Estrutura da cromatina de ordem superior. Quando a cromatina está em forma condensada, os nucleossomos adjacentes não estão separados por espaço igual ao comprimento do DNA ligador; em vez disso, os nucleossomos dobram sobre si mesmos para formar uma estrutura densa, altamente condensada que compõe uma fibra com diâmetro de 30 nm. O próximo nível superior da estrutura da cromatina é uma série de alças de fibras de 30 nm, cada uma ancorada em sua base por proteínas. Em média, cada alça inclui 20.000 a 100.000 pb de DNA e mede cerca de 300 nm de comprimento, mas as alças individuais variam muito. As fibras de 300 nm são comprimidas e dobradas para produzir uma fita de 250 nm de largura. O rígido enrolamento helicoidal da fibra de 250 nm, por sua vez, produz a estrutura que aparece na metáfase – cromátides individuais de aproximadamente 700 nm de comprimento.

Resumindo.....

1-      No nível mais simples, a cromatina é uma estrutura helicoidal de duas fitas de DNA.

2-      O DNA é complexado com as histonas para formar nucleossomos.

3-      Cada nucleossomo (11nanometros) – é composto por oito proteínas histonas ao redor das quais o DNA se enrola.

4-      Os nucleossomos se dobram para produzir uma fibra de 30 nm (Solenóide).

5-      ... que forma alças com 300nm de comprimento em média.

6-      As fibras de 300nm são comprimidas e dobradas para produzir uma fita de 250 nm de largura.

7-      O enrolamento apertado da fibra de 250nm de largura produz a cromátide de um cromossomo (1400 nm – cromossomo).

Mudanças na estrutura da cromatina

Embora o DNA eucariótico precise estar bem condensado para caber no núcleo da célula, ele também precisa ser desenrolado periodicamente para que ocorra transcrição e replicação.

Cromossomos politênicos. Cromossomos gigantes chamados de cromossomos politênicos são encontrados em alguns tecidos da Drosophila e outros organismos. Os cromossomos politênicos forneceram indícios da natureza transformante da estrutura da cromatina. Esses grandes cromossomos incomuns surgem quando ciclos repetidos de replicação de DNA ocorrem sem divisões celulares, produzindo milhares de cópias de DNA que ficam lado a lado. Várias bandas são reveladas quando esses cromossomos são destacados com corantes. Sob certas condições, as bandas exibem puffs cromossômicos – intumescências localizadas do cromossomo. Cada puff é uma região da cromatina que tem uma estrutura relaxada e, consequentemente, um estado mais aberto.

Sensibilidade à enzima DNase I. Uma segunda evidência de mudança da estrutura da cromatina com a atividade dos genes é a sensibilidade à DNase I, uma enzima que digere DNA. A capacidade dessa enzima em digerir DNA depende da estrutura da cromatina: quando o DNA está firmemente preso a proteínas histona, é menos sensível à DNase I, enquanto o DNA não ligado é mais sensível à DNase I.

Qual é a natureza da alteração da estrutura da cromatina que produz puffs cromossômicos e a sensibilidade à DNase I? Em ambos os casos, a cromatina relaxa; aparentemente, as histonas afrouxam sua fixação ao DNA. Um processo que altera a estrutura da cromatina é a acetilação. Enzimas chamadas acetiltransferases prendem grupos acetila aos aminoácidos lisina nas caudas da histona. Essa modificação reduz as cargas elétricas positivas que normalmente existem na lisina e desestabiliza a estrutura do nucleossomo, e então as histonas seguram o DNA com menos firmeza. Outras modificações químicas das proteínas histona, como metilação e fosforilação, também alteram a estrutura da cromatina, como as proteínas especiais de remodelagem da cromatina que se ligam ao DNA.

Alterações epigenéticas associadas a modificações da cromatina. Vamos observar como a estrutura da cromatina pode ser alterada por meio de modificação química das proteínas histona. Várias outras mudanças também podem afetar a estrutura da cromatina, incluindo a metilação do DNA, o uso de histonas diferentes no nucleossomo e a ligação de proteínas ao DNA e à cromatina. Embora essas mudanças não alterem a sequência de DNA, elas têm efeitos importantes na expressão dos genes.

Algumas mudanças na estrutura da cromatina são retidas por meio da divisão celular, e então elas são transmitidas para as gerações futuras das células e até para gerações futuras dos organismos em alguns casos. Alterações estáveis da estrutura da cromatina que podem ser passadas para células ou organismos individuais são chamadas de alterações epigenéticas, ou simplesmente epigenética. Diferente das mutações, as alterações epigenéticas não alteram a sequência de DNA, podem ser revertidas e muitas vezes são influenciadas por fatores ambientais.

Mais detalhado:  A epigenética altera a expressão dos genes; essas alterações são estáveis o suficiente para serem transmitidas por mitose (e, às vezes, por meiose), mas também podem ser alteradas. A maioria das evidências sugere que os efeitos genéticos são produzidos por mudanças físicas na estrutura da cromatina.

Vamos analisar três tipos de mecanismos moleculares que alteram a estrutura da cromatina e sustentam muitos fenótipos epigenéticos: (1) mudanças nos padrões de metilação do DNA; (2) modificações químicas das proteínas histona e (3) moléculas RNA que afetam a estrutura da cromatina e a expressão gênica.

Metilação do DNA

O mecanismo mais bem compreendido da mudança epigenética é a metilação do DNA. A metilação do DNA refere-se ao acréscimo de grupos metila às bases de nucleotídeos. Nos eucariotos, o tipo predominante de metilação de DNA é a metilação da citosina para produzir 5-metilcitosina. A metilação do DNA está associada à repressão da transcrição. As células reprimem e ativam os genes ao metilar e desmetilar as bases citosina. Enzimas chamadas DNA metiltransferases metilam DNA ao adicionar grupos metila a bases de citosina para criar 5-metilcitosina. Outras enzimas chamadas de desmetilases removem os grupos metila, convertendo 5-metilcitosina de volta para citosina.

Manutenção da metilação. O fato de que as mudanças epigenéticas são transmitidas para outras células e (às vezes) para gerações futuras significa que as mudanças na estrutura da cromatina associadas aos fenótipos epigenéticos têm de ser fielmente mantidas quando os cromossomos se replicarem. Como as mudanças epigenéticas são mantidas e replicadas durante o processo de divisão celular? A metilação de sequências CpG significa que duas bases citosina metiladas estão em diagonal uma da outra em fitas opostas. Antes da replicação, as bases citosina em ambas as fitas são metiladas. Imediatamente após a replicação semiconservativa, a base citosina na fita molde estará metilada, mas a base citosina na fita recém-replicada, não. Enzimas metiltransferases especiais reconhecem o estado hemimetilado dos dinucleotídios CpG e adicionam grupos metila a bases citosina não metiladas, criando duas novas moléculas de DNA totalmente metiladas. Dessa forma, o padrão de metilação do DNA é mantido durante a divisão celular.

Modificações da histona

As mudanças epigenéticas também podem ocorrer pela modificação das proteínas histona. Nas células eucarióticas, o DNA é complexado a proteínas histona na forma de nucleossomos, que são as unidades repetidas básicas da estrutura da cromatina. Já foram detectadas mais de 100 diferentes modificações pós-tradução das proteínas histona. Muitas dessas modificações ocorrem nas caudas com carga elétrica positiva das proteínas histona, que interagem com o DNA e afetam a estrutura da cromatina. As modificações nas histonas incluem o acréscimo de fosfatos, grupos metila, grupos acetila e ubiquitina a suas caudas. Essas modificações alteram a estrutura da cromatina e afetam a transcrição dos genes. As modificações também servem como sítios de ligação para proteínas como fatores de transcrição necessários para esse processo.

Manutenção das modificações da histona. O processo pelo qual as modificações da histona são mantidas durante a divisão celular ainda não está bem compreendido como a metilação do DNA. Não existe mecanismo universal para manter as modificações da histona; diferentes tipos de modificações são indubitavelmente mantidos por mecanismos diferentes.

Efeitos epigenéticos produzidos pelas moléculas de RNA

Novos indícios demonstram que as moléculas de RNA são importantes para produzir os efeitos epigenéticos. O primeiro descoberto e ainda mais bem compreendido exemplo de mudança epigenética mediada por RNA é a inativação do X, na qual um longo RNA não codificado chamado Xist suprime a transcrição de um dos cromossomos X nas fêmeas dos mamíferos. Outro exemplo envolve a paramutação no milho, no qual um alelo epigeneticamente alterado induz uma mudança em outro alelo que então é transmitido para gerações futuras. A paramutação no milho é produzida por siRNAs. Ocorrem outros exemplos de fenótipos epigenéticos associados a RNA pelas moléculas siRNAs que silenciam genes e elementos de transposição ao direcionar a metilação do DNA ou modificações da histona em sequências específicas de DNA.

21.3 Os processos epigenéticos produzem um conjunto variado de efeitos

Inicialmente, acreditava-se que os mecanismos epigenéticos fossem importantes em um pequeno número de fenótipos incomuns. Entretanto, a pesquisa nos últimos 15 anos revelou que a epigenética sustenta um arranjo impressionante e até crescente de fenômenos biológicos. Vamos examinar alguns exemplos desses efeitos epigenéticos nesta seção.

Paramutação (variabilidade?)

Um dos primeiros exemplos de epigenética foi um fenótipo curioso que Alexander Brink descreveu no milho nos anos 1950. Brink estava estudando o locus r1, que ajuda a determinar a pigmentação nas sementes do milho. O alelo Rr nesse locus produz grãos púrpura, enquanto o alelo Rst codifica grãos manchados. Brink observou que quando Rst estava presente em um genótipo com o alelo Rr, o alelo Rst alterava de forma permanente a expressão do alelo Rr, de modo que agora ele também produzia sementes manchadas. Esse efeito reduzido do alelo Rr alterado sobre a pigmentação persistiu por várias gerações, mesmo na ausência do alelo Rst. Brink chamou esse fenômeno de paramutação. A paramutação viola o princípio de segregação de Mendel, que afirma que quando os gametas são formados, cada alelo se separa e é transmitido de forma independente para a próxima geração.

Atualmente, a paramutação é definida como uma interação de dois alelos que leva a uma mudança que pode ser herdada na expressão de um dos alelos. É surpreendente que a paramutação produza essas diferenças no fenótipo sem qualquer alteração na sequência de bases do DNA do alelo convertido. O fenômeno da paramutação tem várias características importantes. Primeiro, o padrão de expressão recém-estabelecido do alelo convertido é transmitido para as gerações futuras, mesmo que o alelo que produza a alteração não esteja mais presente. Segundo, o alelo alterado agora é capaz de converter outros alelos para o novo fenótipo. E terceiro, não existem diferenças associadas de sequência de DNA nos alelos alterados.

Epigenética comportamental (variabilidade ou variação??)

A pesquisa mostrou que as experiências de vida, especialmente as obtidas no início da vida, podem ter efeitos duradouros no comportamento e, em alguns casos, nas gerações futuras. Os pesquisadores estão descobrindo que esses efeitos duradouros são mediados por processos epigenéticos. O número de estudos que demonstram de forma convincente que a experiência de vida altera a estrutura da cromatina é pequeno no momento (e alguns ainda são controversos), mas vários pesquisadores estão procurando por efeitos epigenéticos de experiência e seus efeitos duradouros na estrutura da cromatina e no comportamento.

Mudanças epigenéticas induzidas pelo comportamento materno. Um exemplo fascinante de epigenética comportamental é observado nos efeitos duradouros do comportamento maternal nos ratos. Uma fêmea lambe e cuida de seus descendentes, enquanto ela se curva e os amamenta. Os descendentes das fêmeas que apresentam um comportamento mais evidente de lamber e cuidar têm menos medo quando adultos e mostram respostas hormonais reduzidas ao estresse comparados com os descendentes de fêmeas que lambem e cuidam menos.

Imprinting genômico (variabilidade?)

Os organismos diploides em geral têm dois alelos em cada locus autossômico, um alelo herdado da mãe e um alelo herdado do pai. Para a maioria dos genes, ambos os alelos são expressos, e o efeito de um alelo específico no fenótipo é independente de qual genitor transmitiu o alelo para os descendentes. Entretanto, para alguns genes, o sexo do genitor que contribuiu com o alelo influencia como este é expresso; alelos herdados da mãe e do pai não são equivalentes. Esse fenômeno, no qual o sexo do genitor que transmite o alelo determina sua expressão, é chamado de imprinting genômico. Para alguns genes imprintados (imprinted), o alelo herdado do genitor é expresso e o alelo herdado da genitora é silenciado; para outros genes, o alelo herdado da genitora é expresso e o alelo herdado do genitor é silenciado. acredita-se que o imprinting genômico seja responsável por diferentes graus de metilação dos genes herdados dos genitores. O imprinting genômico é causado por diferenças epigenéticas nos alelos herdados dos genitores. A hipótese de conflito genético sugere que o imprinting se desenvolve por causa das pressões evolutivas conflitantes que agem sobre os alelos maternos e paternos.

Griffits: A consequência do imprinting parental é que os genes imprintados são expressos como se fossem a única cópia do gene presente na célula, muito embora existam duas. E importante lembrar que nenhuma mudança é observada nas sequências de DNA de genes imprintados, isto é, o gene idêntico pode ser ativo ou inativo na prole, conforme tenha sido herdado da mãe ou do pai.

Os cromossomos eucarióticos têm centrômeros e telômeros

Os cromossomos se separam na mitose e meiose e permanecem estáveis durante muitas divisões celulares. Essas propriedades dos cromossomos surgem a partir das características estruturais especiais dos cromossomos, incluindo os centrômeros e telômeros.

Estrutura do centrômero

O centrômero é uma região contraída do cromossomo ao qual as fibras de fuso se prendem e é essencial para o movimento correto do cromossomo na mitose e meiose. O papel essencial do centrômero no movimento do cromossomo foi identificado pelos primeiros geneticistas, que observaram as consequências da ruptura do cromossomo. Quando uma ruptura de cromossomo produz dois fragmentos, um com um centrômero e um sem, o fragmento de cromossomo com centrômero se fixa às fibras do fuso e se move na direção do polo. O fragmento sem centrômero não se conecta à fibra do fuso e é perdido porque não consegue se mover para o núcleo da célula irmã durante a mitose. Os centrômeros são sítios de ligação para o cinetócoro, ao qual as fibras do fuso se ligam. A maior parte do centrômero é feita de heterocromatina. Surpreendentemente, não existem sequências específicas encontradas em todos os centrômeros, o que levanta a questão sobre o que determina exatamente onde o centrômero está. A pesquisa sugere que a maioria dos centrômeros não está definida por sequência de DNA, mas por alterações epigenéticas na estrutura da cromatina. Os nucleossomos nos centrômeros da maioria dos eucariotos têm uma proteína histona diferente chamada CenH3, que toma o lugar da histona H3. A histona CenH3 traz uma mudança no nucleossomo e na estrutura da cromatina, que possivelmente promove a formação do cinetócoro e a fixação das fibras do fuso ao cromossomo.

Estrutura do telômero

Os telômeros são as extremidades naturais de um cromossomo. O trabalho pioneiro de Hermann Muller (nas moscas-da-fruta) e Barbara McClintock (no milho) mostrou que as rupturas do cromossomo produzem extremidades instáveis com tendência a se unirem e capazes de degradar o cromossomo. Como a fixação e a degradação não ocorrem nas extremidades de um cromossomo com telômeros, cada telômero funciona obrigatoriamente como uma tampa que estabiliza o cromossomo. Os telômeros também fornecem meios para replicar as extremidades do cromossomo.

O DNA eucariótico compreende três classes importantes: DNA de sequência única, DNA moderadamente repetitivo e DNA altamente repetitivo. O DNA de sequência única é composto por sequências que existem em uma ou algumas cópias; o DNA moderadamente repetitivo é composto por sequências que podem ser muitas centenas de pares de bases de comprimento e encontra-se em milhares ou centenas de milhares de cópias. O DNA altamente repetitivo é composto por sequências muito curtas repetidas em tandem e encontra-se em centenas de milhares a milhões de cópias. A densidade dos genes varia muito entre e até dentro dos cromossomos.

CONTRIBUIÇÃO PARA VARIAÇÃO E/OU VARIABILIDADE GENÉTICA: paramutação e imprinting = efeitos da epigenética?